一、完全培养基的制备

1. 在2-8°C条件下解冻小鼠小肠类器官完全培养基。
2. 将解冻后培养基上下颠倒充分混匀，在超净工作台中将培养基进行分装，推荐分装成10ml规格。
3. 分装后的完全培养基可于-20°C 储存，避免反复冻融。使用前于2-8°C解冻，充分混匀后使用。解冻后的培养基建议2-8°C保存，并在规定期限内使用完毕。

二、基质胶的解冻

1. 基质胶应提前置于2-8°C冰箱中过夜解冻，全程保持低温操作。
2. 全程冰上操作，禁止反复冻融，所有接触耗材，枪头、EP管和离心管建议提前置于2-8°C或-20°C预冷。

三、类器官复苏

1. 实验开始前，将24孔板提前在37°C培养箱中预热至少30分钟。
2. 提前在37°C条件下预热类器官专用基础培养基。
3. 在37°C水浴中快速解冻类器官冻存管(约1-2分钟)，仅剩少量冰晶时立即停止，转移至操作台。
4. 将类器官悬液转移至离心管，缓缓加入5倍体积预热的类器官专用基础培养基，轻轻混匀。
5. 以300xg离心5分钟，弃上清，所得类器官沉淀可用于后续类器官培养。
6. 用适量基质胶重悬类器官沉淀，避免完全吹打成单细胞，建议保留约50-100um的小团块。接种密度以胶滴内类器官均匀分布、不过度重叠为宜。
   注意:此步骤速度要尽可能快，避免基质胶温度升高而凝固;吹打时注意不要产生气泡。基质胶需用碎冰包裹，于4°C过夜解冻。操作前，将所有接触基质胶的耗材预冷。
7. 将基质胶和类器官的混合悬液点入24孔板底部正中央，避免悬液接触孔板侧壁，每孔30-50 uL 左右。
8. 将接种后的培养板置于37°C培养箱中孵育约20分钟，待基质胶完全凝固。
9. 沿孔壁加入预热的小鼠小肠类器官完全培养基(24孔板每孔500uL)，置于培养箱培养，定期观察记录。

四、类器官传代

1. 当类器官直径约200-1000um、结构较密集，或培养4-7天后，建议根据生长状态进行传代;避免类器官长期过度生长后出现明显中心变暗或坏死。
2. 小心弃去培养基，每孔加入500uL类器官专用基础培养基(提前2-8°C预冷)，用润洗液润洗过的枪头吹打5~10次，将基质胶滴连同类器官一起吹起，转移至15mL离心管中。如有多个孔可合并。
   注意:移取类器官前枪头都应用类器官抗粘附液润洗，以减少类器官损失。后续不再特意注明。
3. 300xg离心5分钟，弃上清。
4. 根据沉淀量，加入相对于沉淀体积3倍的类器官传代消化液，37°C消化3~10分钟，每3分钟镜检观察，直至消化成小的类器官团块，避免过度消化至单细胞状态，过度消化可能导致复苏/传代后成活率降低或生长缓慢
5. 消化完成后，加入5倍体积类器官专用基础培养基终止消化，然后300xg离心5分钟，弃上清。
6. 收集类器官后，参照传代步骤进行清洗，并根据类器官大小适度消化或机械吹打成小团块，避免完全消化成单细胞。

五、类器官冻存

1. 收集类器官，参照传代步骤进行清洗，并根据类器官大小适度消化或机械吹打成小团块，离心得到沉淀，避免完全消化成单细胞。
2. 建议每管冻存相当于2-3个24孔板孔的类器官量，使用类器官冻存液重悬类器官沉淀。
3. 分装至冻存管(建议1mL/管)，置于程序降温盒或逐步降温(-80°C过夜后移入液氮长期保存)。